Transmisión de virus no patógenos por trasplantes fecales.

Los transplantes fecales comenzaron  a  ser usados  hace tiempo (1950), pero es desde no hace tanto, que les hemos empezado a dar más uso. Las razones son entre otras, que sabemos más de técnicas de taxonomía bacteriana para poder aplicar el transplante con más control. Y la principal razón de uso es la gran eficacia contra enfermedades gastrointestinales, como por ejemplo las diarreas crónicas causadas por Clostridium difficile, con un índice de curación cercano al 90% (algo de lo que se habló en el blog desde otra perspectiva).
Los donantes fecales pasan varios controles, al igual que otros donantes como los de sangre. Sin embargo hay algo en lo que no se había pensado...y es en la transmisión de virus no patógenos.  Los virus no patogénicos forman parte de nuestro organismo sin causar enfermedades, os animo a ver las conferencias del último evento Naukas sobre virus,  Estos virus viven tanto de forma independiente como integrados en nuestro genoma o incluso en el de las bacterias del microbioma humano, dando forma al llamado "viroma humano".
Con el transplante fecal pasan por lo tanto muchos virus no patogénicos de donante a paciente,  el estudio publicado en journal of the American Society for Microbiology, habla de como las comunidades de virus son transportadas durante el transplante fecal.

Se estudiaron tres niños que padecían colitis ulcerosa crónica tratados con materia fecal de un donante sano.  Se miró la presencia de familias víricas antes, durante y después del tratamiento

Familias de bacteriophago presentes
 http://mbio.asm.org/content/7/2/e00322-16/F1.expansion.html

Lo primero que pudieron comprobar los investigadores era que no se transmitían virus animales, sólo se observó la presencia de virus que afectan a bacterias (bacteriofagos). También se observó la persistencia de los virus transmitidos por el donador o los que tiene el paciente.

mbio.gaia.net/content/7/2/e00322-16/F2.expansion.html

Ambos pacientes se encontraban en remisión y con buen pronóstico tras el tratamiento. La preocupación que puede existir tras este descubrimiento se basa en que los bacteriófagos pueden portar fragmentos de ADN que confieran capacidades tóxicas o resistencia a antibióticos a las bacterias, ¿os acordáis del problema con la soja alemana del que se acusó al pepino español? En cualquier caso los investigadores también dicen que es un problema menor si se lo compara con la hipotética situación en la que se transmitiesen virus animales....

Es más, os digo algo a título personal.  Es posible que los causantes de la recuperación no sean sólo bacterias que pertenecen a una comunidad microbiana intestinal sana y rica en biodiversidad. Es posible que los virus que viven en el intestino tengan mucho que decir al respecto de esta recuperación. Y es que un ecosistema complejo a más diverso más estable y sano...

Titulación de fagos.

¿Cómo saber cuantos virus existen aproximadamente en una dilución?

Los virus son por lo general organismos muy, muy pequeños, por lo que contarlos no sería tarea factible con los métodos que usamos con las bacterias. En estos casos, más que buscar turbidez o colonias, tendremos usar métodos indirectos, más concretamente la propia huella que deja el virus al matar bacterias.

Lógicamente esto sólo es posible con virus que parasitan bacterias.

Los virus son parásitos intracelulares obligados, necesitan utilizar la maquinaria de células vivas para poder multiplicarse. Los virus que infectan bacterias se llaman bacteriófagos o sencillamente fagos.

Existen dos clases de fagos:

·Fagos líticos o "virulentos", son los que tras introducir su información genética en la bacteria comienzan a dividirse hasta matar a la misma, liberándose al lisar la bacteria. (ciclo lítico)

·Fagos lisogénicos o "atenuados", tras infectar la bacteria, su genoma puede integrarse en el cromosoma bacteriano convirtiéndose en un profago que se divide a la vez que la bacteria (ciclo lisogénico) El virus puede liberarse y entrar en ciclo lítico.

From: Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 December 30; 105(52): 20705–20710.

Published online 2008 December 19. doi: 10.1073/pnas.0808831105

Para esta técnica necesitamos preparar una suspensión de fagos virulentos que se mezclarán en suspensión con bacterias susceptibles de ser infectadas, preferiblemente en fase exponencial. Se mantendrá el cultivo en suspensión para que los fagos se multipliquen y luego se centrifugará para eliminar los restos celulares.

Para calcular el número de partículas virales se mezcla una determinada dilución de la suspensión fágica con un cultivo bacteriano en fase exponencial y se coloca sobre la superficie de una placa de agar.

Tras la incubación se observa un césped bacteriano sobre el que aparecen pequeñas areas circulares más claras que corresponden a los virus. Estas áreas reciben el nombre de calvas de lisis.

Cada calva corresponde a la infección por un único virus por lo cual contando y realizando cálculas se puede llegar a conocer la carga vírica de la suspensión inicial en UFP/ml (unidades formadoras de placa por mililitro)

Entramos a más detalle en el procedimiento de recuento:

Hay que preparar diluciones decimales seriadas desde 10^-1 hasta 10^-9, además también prepararemos un control de la bacteria sin fagos y otro de fagos sin diluir.

Preparamos tubos con agar blando a los que añadimos 0'1 ml de la bacteria.

Luego añadimos 0'1 ml de cada disoluciones de fagos a los tubos de manera que tendremos un tubo con cada una de las disoluciones víricas, más el control y otro únicamente de fagos sin diluir. Luego añadiremos cada tubo a una palca con agar nutritivo y dejaremos solidificar, para poner luego a incubar.

Al día siguiente se observan las calvas de lisis, y se proceden a contar. Lo normal es que en las diluciones bajas sea muy difícil contar, así que lo haremos a partir de diluciones altas, cuando sea razonablemente posible.

Aquí vemos el resultado:

Placa control, que nos descarta la existencia de virus y confirma el crecimiento de nuestra bacteria. En este caso Escherichia coli Y190.

10^-6, como puede observarse contar las calvas es prácticamente imposible.

10^-7, el número de calvas empieza a ser más razonable.

10^-8, aquí ya podemos contar unas 44 calvas.

10^-9, en esta dilución contamos 6 calvas.

Confirmando que no se han producido saltos entre las diluciones ni contaminaciones, podemos dar con concluido el experimento. Para los cálculos finales usaremos la última placa en la que aparezcan calvas. El título corresponderá al número de calvas multiplicado por la dilución total. En este caso 6 x 10⁹ UFP/ml. Pero en otros casos, dependiendo de como se tomen, esta cuenta puede variar.

Es importante realizar siempre los experimentos por duplicado, para descartar saltos o problemas con alguno de los elementos implicados.

Colífagos y verotoxinas.

Escherichia coli y la crisis del pepino

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