sábado, 19 de diciembre de 2009

Analisis de heterocariontes.

Los hongos filamentosos son organismos constituidos por células cilíndricas, de 3 a 12 µm de diámetro, que forman largos filamentos denominados hifas. Estas, crecen por elongación de su extremo distal y desarrollan ramificaciones laterales, generando redes entrelazadas denominadas micelios.
Micelios de Fusarium

En buenas condiciones las masas de micelios alcanzan un buen tamaño, pudiéndose observarlas a simple vista, formando las típicas colonias de hongos. Estas suelen producir esporas y acumular pigmentos, los cuales les confieren los típicos colores, verde, amarillento o anaranjado.

Lo hongos son heterótrofos, poseen una enorme capacidad de metabolizar todo tipo de sustratos químicos, además su metabolismo secundario produce una gran cantidad de sustancias de interes (antibióticos, enzimas, micotoxinas, etc).

Otra de las razones para seleccionarlos, es su rápido ciclo vital, el cual es perfectamente reproducible en laboratorio. Las facilidades que ofrecen los convierten en perfectos modelos para investigación genética.

Estos hongos, además de haploides, son cenocíticos, es decir que poseen más de un núcleo. Muchos poseen tabiques que separan distintos citoplasmas, los cuales poseen varios núcleos. Mientras otros no tienen tabiques, constituyendo una enorme célula con muchísimos núcleos.
Esta característica permite el estudio de heterocariontes, es decir estirpes con más de un núcleo genotípicamente distinto. Y en este aspecto nos vamos a centrar.


Nuestro objetivo se centrará en conseguir heterocariontes para distintas mutaciones, para ellos dividiremos el experimento en dos, el primero será para Fusarium fujikuroi(esporas uninucleadas e hifas tabicadas), y el segundo para Phycomices blakesleeanus (esporas multinucleadas e hifas no tabicadas).

Las técnicas que vamos a manejar son:
  1. Cultivo y observación al microscopio de hongos filamentosos
  2. Obtención y caracterización fenotípica de mutantes
  3. Obtención de heterocariontes y análisis de complementación
  4. Segregación de núcleos de un heterocarionte y calculo de sus proporciones

Dicho con palabras más comprensibles: cultivar y ver los hongos al microscopio, para ver los tabicados y los no tabicados. Observar el aspecto que muestran los mutantes (color de colonias, crecimiento o no de las mimas...). Unir mutantes para analizar resultados.


Experimento 1:

Identificación de mutantes espontáneos y utilización para la obtención de heterocariontes de Fusarium. Se buscaran mutantes para una ruta anabólica (asimilación de nitrato) mediante resistencia al clorato, se identificaran con un test de crecimiento las distintas clases genotípicas, asociadas a mutaciones en genes diferentes, y se seleccionarán los mutantes adecuados para la obtención de heterocariontes.
Fase 1:

Se cultiva en una placa de Petri 12 transplantes de una cepa silvestre de Fusarium fujikuroi FKMC1995. Después se le deja incubando a 30ºC durante 6 días.

Fase 2:

Una vez han crecido las distintas (12) colonias en nuestra placa, pasamos a cultivar muestras en distintos medios de crecimiento. Nuestro objetivo es buscar sectores resistentes al clorato.
Usando 4 medios mínimos (MM), tomamos una muestra de la placa inicial, y vamos cultivando en los distintos 4 medios siempre en la misma posición para diferenciar las (4x12) colonias aún estando en distintas placas. El orden de cultivo también es importante:

  1. MM+NO3.
  2. MM+NO2.
  3. MM+hipoxantina.
  4. MM+asn.
Hay que recordar que la ruta metabólica para la síntesis de amino ácidos en Fusarium es la siguiente:

NO3-->NO2-->Amonio--> Glutamina-->Amino ácidos.

Existe otra paralela, en la cual se incorpora hipoxantina en hacia el amonio.

Hipoxantina-->Amonio-->glutamina-->Amino ácidos.

El medio en el que lo pusimos a crecer es un medio con clorato, que es inofensivo, pero por similitudes, el gen que pasa el Nitrato, a nitrito, hace lo mismo con el clorato, pasándolo a clorito, sustancia que si es tóxica. Así que los hongos que hayan crecido deben ser mutantes obligados.
Se dejan las 4 placas a 30ºC crecer durante 6 días.


Fase 3:

Se determina el patrón de crecimiento de las colonias. Ninguna debe crecer en nitrato (MM+NO3) y todas deben crecer en asparragina (MM+asn) Las que no cumplan estos dos requisitos se descartan. Las que los cumplan se separan en 4 grupos según crezcan en nitrito (MM+NO2) o en HX ( MM+hipoxantina)

Entrando un poco más en las encimas, y usando las rutas citadas antes, vemos los siguientes genes:

niaD: Nitrato reductasa, se ocupa de pasar de NO3 a NO2
nitR: Nitrito reductasa, regula/codifica a niaD y participa en el paso NO2 a amonio
cnx: Cofactor de molibdeno, regula a nitR y los distintos enzimas que transforman la hipoxantina en amonio.



NO
3-(niaD y nitR)->NO2-(nitR y cnx)->Amonio--> Glutamina-->Amino ácidos.

Hipoxantina-(cnx)->Amonio-->glutamina-->Amino ácidos.

Esta sería la ruta añadiendo además los genes.

Con esto y las distintas placas podríamos ver "de que gen cojean"

Por ejemplo




Distintos medios con Fusarium

Una vez identificados los distintos mutantes, se siembran en una placa con MM NO2 cuatro pares de estirpes con distintos genotipos (por ejemplo: niaD-nitR/niaD-cnx/nitR-cnx/niaD-cnx ) Las siembras, a unos dos centímetros de separación cada par. Después se incuban a 30ºC durante al menos una semana.

Fase 4 :

Se determina la presencia o no de complementación para las parejas de mutantes. La complementación se muestra como una banda de crecimiento entre ambas estirpes.
Pondré unas fotos de nuestro cultivo, en la cual se pueden observar 4 bandas de crecimiento, dos de ellas muy claras. Una en el sector de las 12:00 a las 15:00 (niaD+cnx) y otra en el sector 15:00 a 18:00 (nitR+cnx). Las otras dos bandas una se da entre nitR del sector de las 15:00 a las 18:00 y el cnx del sector de las 18:00 a las 21:00, la ultima banda se da en ese mismo sector entre cnx y niaD. Cabe aclarar que todos los cnx vienen de distintas estirpes.

El crecimiento se produce al principio sobre todo en el centro, pues es donde se forma el heterocarionte, que posee núcleos de ambos tipos, supliendo sus mutaciones con los genes silvestres del otro.


Experimento 2:


El segundo experimento lo llevaremos a cabo con Phycomyces.

Fase 1:

Queremos cultivar unas veinte esporas en una placa, pero al tener como fuente de ellas una suspensión que tiene 106 esporas/ml tenemos que utilizar la técnica de las diluciones seriadas.
Una vez obtenidas las esporas deseadas se siembran en "cesped" y se dejan incubar durante cinco días a 22ºC.

Fase 2:


Una vez han crecido las colonias, procedemos a contar el número de colonias con los tres fenotipos posibles:
Phycomyces fungi, showing sporangiophores (fruiting bodies)
in the wild type and color mutants. Photo by Tamotsu Ootaki.

Amarillo (heterocarionte)

Albino (homocarionte carB)
Rojo (homocarionte carR)
Esta trama de los colores, se basa en la siguiente ruta:

Fitoeno [Incoloro]---(carB)-->Licopeno [Rojo]---(carR)--> β-caroteno [Amarillo anaranjado]


Así pues, las colonias que tengan mutado el gen carB , serán colonias albinas. Mientras que los que tengan mutado el gen carR únicamente, producirán colonias rojas. Por último los heterocariontes producirán colonias amarillentas.

Hay que calcular sus frecuencias y se presentan en un gráfico para cálculo de frecuencias nucleares.


gráfico para cálculo de frecuencias nucleares.


Para entender como funciona pondré un ejemplo, si plantáramos desde el Tubo N una serie de esporas en una placa y nos crecieran:

Tubo N:
10 colonias Rojas
20 colonias Albinas
70 colonias Amarillas




Obtendríamos eso, en la línea del medio, pondríamos el número de colonias amarillas, contando como 10 cada "mini-triangulo". Lo mismo con las respectivas colonias rojas y albinas.
Respecto al punto donde estén las colonias homocariontes (amarillas) trazamos una línea horizontal que corte el triangulo. Con los puntos de corte de las colonias heterocariontes, trazamos sendas líneas, estas líneas van paralelas cada una a las líneas principales de heterocariontes. Tenemos que elegir dos líneas que pasen por el punto de donde está la X y que además corten en algún punto entre ellas y la línea amarilla horizontal, todo a la vez.

Donde corten las 3 líneas, procederemos a pintar una línea vertical (la azul), que cortará con la curva. Indicándonos la frecuencia nuclear deseada.


Referencias & fuentes.

Universidad de biología de sevilla
Departamento de genética de la US
ResearchBlogging.orgHeisenberg M, & Cerdá-Olmedo E (1968). Segregation of heterokaryons in the asexual cycle of Phycomyces. Molecular & general genetics : MGG, 102 (3), 187-95 PMID: 5711442


1 comentario:

  1. Es fantástica la explicación de la práctica.

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